RNA/DNA比值測定

1.所需藥品及方法：

  1、0.6mol/L HClO₄ 溶液配制，市售HClO₄ 48.94mL溶于適量超純水中，定容至1000mL

     0.2mol/L HClO₄ 溶液配制，市售HClO₄ 16.31mL溶于適量超純水中，定容至1000mL

  2、0.05 mol/L pH=7.4 Tris-HCl 緩沖液配制，500mL 0.1mol/L Tris溶液+420.0mL HCl溶液混合，超純水定容至1000 mL。

  3、0.3mol/L KOH 溶液配制，16.8g KOH固體溶于適量超純水，冷卻后定容至1000mL。

 

[測定方法]

1、把適量肌肉與緩沖液(0.05mol Tris_HCl,pH=7.4)混合勻漿,取1.4 mL勻漿液和0.7mL冷的HClO₄（0.6mol/L）混合,于冰上冷卻15 min后,在4℃下離心(10000r/min)10 min,去掉上清液；

2、將沉淀用1.12mL KOH（0.3mol/L）的在37℃水浴1h后冰浴30 min,離心(方法同上)。取其上清液,于751G型分光光度計(上海分析儀器廠)上讀取260 nm處的吸光值,此為RNA在260 nm處的吸光值；

3、將沉淀用2.0mL冷的HClO₄（0.2 mol/L）洗滌,離心,去掉上清液。在沉淀中加入2.2mL HClO₄（0.6 mol/L）于85℃水浴中15 min后,再冰浴15 min,離心,取其上清液,在260nm處測吸光值,此為DNA在260nm處的吸光值。從而估測RNA/DNA的比值。

 

 

 

 

 

蛋白酶活力測定

1.所需藥品及方法

 1、福林試劑，待購。

 2、0.55mol/L Na₂CO₃溶液，58.3g Na₂CO₃超純水溶解，定容至1000 mL。

 3、10%三氯乙酸（質量分數）。

 4、0.02 mol/L pH7.5磷酸緩沖液：

0.02M 磷酸氫二鈉溶液的配制：取Na₂HPO₄·2H₂O 3.561g (或Na₂HPO₄12H₂O  7.164g)，溶解于1L蒸餾水中。0.02M 磷酸二氫鈉溶液的配制：取NaH₂PO₄ H₂O  2.76g (或NaH₂PO₄ 2H₂O 3.121g)，溶解于1L蒸餾水中。

將0.02mol/L磷酸氫二鈉溶液84mL與0.02mol/L磷酸二氫鈉溶液16mL混合，即為0.02mol/L pH7.5磷酸緩沖液。

5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5 mol/L NaOH 1mL濕潤。再加少量0.02M pH7.5磷酸緩沖液稀釋。在熱水浴中溶解，定容至100mL，冰箱中可保存一周。100mL。 

[材料及實驗器材]：

分光光度計、光徑1.0cm比色杯、離心管、電子天平、離心機、勻漿器、剪子、鑷子、冰塊、試管若干、移液管若干。

[實驗步驟]

1、酶粗提液的制備

取新鮮肝胰臟、胃、腸組織稱重，在冰盤上剔除脂肪及內容物，以10倍緩沖液或去離子水勻漿各組織，將組織懸液低溫下離心（3000rpm/min）,上清液為酶粗提液（酶液）。

2、酶活力測定

（1）標準曲線的制作：精確稱取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N鹽酸溶解，定容至100mL，分別配制溶液0—100μg/mL不同濃度溶液，不同濃度各取酪氨酸溶液1mL，加0.5％酪素2mL，于37℃ 水浴中反應15分鐘，然后加入三氯乙酸3mL，離心除去沉淀。取清液1mL，加入0.55mol/L碳酸鈉5mL，再加入福林試劑1mL，于37℃水浴顯色15分鐘，在680nm波長下比色，測光密度（OD值）。以光密度讀數為縱坐標，酪氨酸的微克數為橫坐標，繪制曲線。

（2）樣品測定

樣品測定設對照管和測定管。

對照管           測定管

適當稀釋酶溶液                    /                0.5mL 去離子水                        0.5mL                /

37℃水浴預熱3---5分鐘

0.5%酪素（預熱過）              1mL                 1mL

37℃水浴準確反應15分鐘

10％三氯乙酸                    1.5mL              1.5mL

離心去除沉淀

取上清液于另外試管內             0.5mL       , ;       0.5mL

0.55mol/L碳酸鈉                  2.5mL               2.5mL

福林試劑                         0.5mL               0.5mL

37℃水浴顯色15分鐘，680nm波長比色，以對照管校零，讀取測定管光密度。

3、計算

在37℃下每分鐘水解酪素產生1μg酪氨酸為一個酶活力單位

蛋白酶的活力單位＝A/15×F

A為樣品測得光密度查曲線，得相應酪氨酸μg數

F 為酶液最終稀釋倍數，15為反應時間（min）

[方法評估]

福林—酚法測定蛋白酶活力是生產實踐和科學研究中應用的基本實驗方法。

[應用意義]

水產動物消化系統內的消化酶隨動物種類而異，而且消化酶的種類和在消化道中分布的差別是和動物食性相適應的。分析消化蛋白酶活力有助于了解動物對蛋白質食物的消化能力，掌握動物的營養需求。

[注意事項]

1、實驗材料應新鮮，不新鮮會發生組織自溶和酶原被破壞。

2、酶液與底物作用時間、作用溫度要嚴格控制，否則數據誤差很大。

3、酶液要用適當緩沖液稀釋到測定光密度在0.2—0.6之間。

 

 

 

 

 

 

   淀粉酶活力的測定

[目的與原理]

掌握淀粉酶活力的測定方法，測定水產經濟動物主要笑話器官的肝胰臟、胃、腸內的淀粉酶活力。

淀粉酶催化淀粉扥子中葡萄糖苷鍵水解，產生葡萄糖、麥芽糖等。在基質充分的條件下，反應后加入的碘液與未被水解的淀粉結合成藍色的復合物，其藍色深淺與未經酶促反應的空白管比較吸光度，從而推算出淀粉酶的活力單位。

[試劑與器材]

   1、0.2%可溶性淀粉

      精確稱取可溶性淀粉1.00g ，置于20mL燒杯內，加入蒸餾水25mL，搖勻使成為淀粉混懸液；稱取無水磷酸二氫鈉13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500mL燒杯內，加入蒸餾水越250mL，煮沸后，將淀粉混懸液倒入此杯內，并用蒸餾水洗滌裝混懸液的燒杯數次，洗滌液亦倒入此燒杯內，繼續煮沸1分鐘，冷卻至室溫后倒入500mL容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至500mL刻度。此淀粉pH應為7.0±0.1，在室溫下課保存2~3個月。

   2、0.1mol/L 碘貯存液：精確稱取碘酸鉀（KIO₃）0.3567g及碘化鉀（KI）4。5g置于100mL容量瓶內，加入蒸餾水80mL，然后緩慢加入濃鹽酸0.9mL，搖勻后用蒸餾水稀釋至100mL刻度，置于冰箱內備用。

   3、0.01mol/L碘應用液：取上述碘貯存液50mL，用蒸餾水稀釋至500mL,盛于棕色瓶中置于冰箱內，可保存1個月。

 

[實驗材料及器材]

     所采集樣品。分光光度計、電子天平、離心機、pH測定儀、恒溫水箱、勻漿器、剪子、鑷子、冰塊、50mL比色管若干、移液管若干，500mL容量瓶，燒瓶。

 

[實驗步驟]

  1、酶提取液的制備（同蛋白酶）

  2、淀粉酶活力的測定

取50mL刻度比色管二只，表明為對照管，測定管。

	對照管	測定管
2%可溶性淀粉	1.0ml	1.0ml
將兩管在37℃水浴中預熱2-5分鐘
酶液	—	0.02mL
測定管混勻后，再置于37℃水浴中反應7.5分鐘
0.01mol/L碘應用液	1.0mL	1.0mL

 

用蒸餾水稀釋至10mL，立即混勻。用660nm或紅色濾光板進行比色，以蒸餾水校正光密度0點，讀取對照管和測定管光密度讀數。

3、計算

   淀粉酶活力單位定義：在37℃、30min內，100mL酶液中的淀粉酶能夠完全水解淀粉10mg稱為一個淀粉酶活力單位。

   淀粉酶活力單位/100mL=（對照管光密度—測定管光密度）/對照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（對照管光密度—測定管光密度）/對照管光密度×800

[方法評估]

測定淀粉酶的方法有很多種，大致可以分為兩類：即測定底物（淀粉）的減少量和測定產物（如還原性糖）的生成量。本實驗采用前者的淀粉—碘比色法。

[注意事項]

1、0.04%可溶性淀粉溶液5mL內淀粉含量為2mg，在本法條件下，當2mg淀粉完全水解時相當于800淀粉酶單位/100mL（即：2/10×30/7.5×100/0.1=800）。

2、對照管內含淀粉2mg，由于淀粉溶液比較穩定，故對照管在固定比色計上的光密度讀書并不改變，因而在測定中不必每次作對照管。

3、當酶液接近800單位時，由于淀粉已幾乎完全被水解，故加入碘液后也不再顯藍色，因此淀粉酶單位較高時（接近600單位）宜將標本稀釋（2~5倍）后重新測定，并將測定結果乘以稀釋倍數。

4、如淀粉溶液出現大量渾濁或者絮狀物，表示淀粉溶液污染或者變質，不能再使用。

5、唾液內含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飛沫污染，也能使測定結果顯著偏高。

 

 

 

 

 

脂肪酶活力的測定

[目的與原理]

掌握脂肪酶活力的測定方法，并測定魚、蝦、貝體內消化器官肝胰臟、胃、腸的脂肪酶活力。

脂肪酶在一定條件下，將甘油三酯水解。在不同水解階段可分別產生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所產生的脂肪酸可以用標準的氫氧化鈉滴定，用滴定值表示酶活力。

[試劑與器材]

試劑：

1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄欖油乳化液：稱取40克聚乙烯醇，加蒸餾水約1000mL，在小火上加熱，并不停攪拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷卻后定容至1000毫升。用雙層紗布過濾，濾液備用；取4％聚乙烯醇溶液300毫升，加100毫升橄欖油，用高速組織搗碎機攪動6分鐘，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液，保存于低溫下（4℃）備用。              400

2、0.025mol/L磷酸緩沖液（pH7.5）

0.025mol/L磷酸氫二鈉溶液的配制：取Na₂HPO₄·2H₂O 4.45g溶于1L蒸餾水中；

0.025mol/L磷酸二氫鈉溶液的配制：取NaH₂PO₄·H₂O 3.45g（或NaH₂PO₄·2H₂O 3.90g）溶于1L蒸餾水中。

將0.025mol/L磷酸氫二鈉84mL與0.025mol/L磷酸二氫鈉16mL混合，即為0.025mol/L磷酸緩沖液。                                                                500     

3、0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液               0.5                          1000

4、1％酚酞指示劑：取1g酚酞溶于100mL 70％乙醇溶劑中。                     100

5、95％乙醇                                                             1000

 

[實驗材料與器材]

魚、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標本。

勻漿器、離心機、恒溫水浴。高速組織搗碎機、酸式滴定管、滴定管架、鑷子、剪子、錐形瓶、移液管、燒杯。

[實驗步驟]

1、酶粗提液的制備（見蛋白酶活力的測定）。

2、取100mL錐形瓶3個，一個作為對照組，另兩個為測定組            

                             對照組      測定組1      測定組2

0.025M磷酸緩沖液（pH7.5）    5mL         5mL          5mL

聚乙醇橄欖油乳化液           4mL              4mL                  4mL

            95％乙醇                     15mL                

                       40℃水浴預熱5—10分鐘

酶液                            1mL                    1mL               1mL

40℃水浴保溫15分鐘（精確計時）

        95％乙醇                              —         15mL           15mL

  酚酞指示劑                   3滴            3滴               3滴

 

用0.05mol/L標準氫氧化鈉滴定至微紅色，記錄滴定消耗的NaOH體積（mL)數。

計算：

酶活力以國際單位表示，即在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產生1微克分子脂肪酸的酶量定為一個國際單位。

 

脂肪酶活力單位＝（A－B）N·f

                          t

式中： A為樣品耗堿液mL數，   B為對照組耗堿液mL數

N為每毫升堿液微克分子數，f為稀釋倍數

t為作用時間 (分)

 [應用意義]

脂肪酶是動物消化脂肪的重要酶類其分泌量和活力與動物對脂肪的消化、吸收、利用有關。水產動物肝胰臟或胰臟是脂肪酶的主要分泌器官，胃腸粘膜及肝臟亦能分泌，有的魚類幽門垂中脂肪酶活力最高。測定水產動物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其對脂肪的消化能力及各部位消化功能狀況。